Bases moleculares y principios de diseño del frente conmutable.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4056 (2023) Citar este artículo

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Durante la migración celular, la polaridad anteroposterior está regulada espaciotemporalmente; sin embargo, el diseño subyacente de las interacciones regulatorias varía. En las células de Myxococcus xanthus con forma de bastón, un interruptor de palanca espacial regula dinámicamente la polaridad anteroposterior. El módulo de polaridad establece la polaridad frontal-trasera garantizando la localización del polo frontal de la pequeña GTPasa MglA. Por el contrario, el sistema quimiosensorial Frz, al actuar sobre el módulo de polaridad, provoca inversiones de polaridad. La localización de MglA depende de los complejos RomR/RomX GEF y MglB/RomY GAP que se localizan asimétricamente con respecto a los polos mediante mecanismos desconocidos. Aquí, mostramos que RomR y las proteínas del dominio de bloqueo MglB y MglC generan una retroalimentación positiva al formar un complejo RomR/MglC/MglB, estableciendo así el polo trasero con alta actividad GAP que no es permisiva para MglA. MglA en el frente participa en una retroalimentación negativa que rompe alostéricamente la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB, asegurando así una baja actividad de GAP en este polo. Estos hallazgos desentrañan los principios de diseño de un sistema de polaridad delantera-trasera conmutable.

La polaridad celular con la localización asimétrica de proteínas dentro del espacio celular es ubicua y fundamental para muchas funciones celulares, incluido el crecimiento y la motilidad1,2,3. Sin embargo, no se comprende bien cómo surge la polaridad a escalas celulares a partir de interacciones locales proteína-proteína y cómo se controla dinámicamente. Los reguladores de polaridad a menudo están conectados para generar redes que incluyen retroalimentación positiva, retroalimentación negativa y/o inhibición mutua2,4,5,6,7. En la regulación transcripcional, está bien establecido que diferentes diseños de circuitos reguladores pueden dar lugar a resultados funcionalmente equivalentes; por ejemplo, la regulación doble negativa es funcionalmente equivalente a la regulación doble positiva8. De manera similar, las redes que regulan la polaridad con resultados funcionalmente equivalentes pueden tener diseños diferentes, lo que plantea la pregunta de por qué se ha seleccionado un diseño de red en particular.

Un tema recurrente en los sistemas reguladores de la polaridad es la localización de la forma activa unida a GTP de una pequeña GTPasa en una única ubicación intracelular6,7,9,10,11,12. La GTPasa, a su vez, interactúa con efectores posteriores para implementar una respuesta específica. Estas GTPasas son interruptores moleculares que alternan entre una conformación inactiva, unida a GDP, y una activa, unida a GTP13. El ciclo de activación/desactivación está regulado por un factor de intercambio de guanina-nucleótido (GEF) similar, que facilita el intercambio de GDP por GTP, y una proteína activadora de GTPasa (GAP), que estimula la baja actividad intrínseca de GTPasa14. Dos sistemas bien estudiados experimental y teóricamente ilustran cómo las redes que regulan la polaridad con diferentes diseños pueden generar resultados equivalentes. En Saccharomyces cerevisiae que carece de la pequeña GTPasa Rsr1, la ubicación del sitio de yema única depende de dónde la GTPasa Cdc42 forma espontáneamente un solo grupo en la membrana. La red reguladora responsable se centra en al menos una retroalimentación positiva que involucra directamente a Cdc424,9. Brevemente, Cdc42-GTP forma espontáneamente un grupo en la membrana y luego recluta un complejo que incluye GEF Cdc249. Debido a que Cdc24 activa Cdc42 adicional, el reclutamiento de Cdc24 estimula la acumulación de Cdc42-GTP adicional, cerrando la retroalimentación positiva9. Los GAP de Cdc42 inhiben el crecimiento del grupo de Cdc42 y pueden ser parte de una retroalimentación negativa9,15,16. En el sistema alternativo, la migración unidireccional de las células en forma de bastón de la bacteria Myxococcus xanthus depende de la localización de la GTPasa MglA en el polo frontal principal. En este caso, la retroalimentación positiva no involucra a MglA sino más bien al andamio GAP MglB y RomR17. En última instancia, estas dos proteínas establecen un polo trasero rezagado con alta actividad GAP, dejando solo el polo opuesto libre para reclutar MglA-GTP17. Por tanto, ambos sistemas generan un único grupo Cdc42/MglA. Aquí, nos centramos en la base mecanicista del establecimiento de la polaridad en M. xanthus y las propiedades funcionales conferidas por la red subyacente en comparación con el circuito que provoca la formación del grupo Cdc42.

M. xanthus migra unidireccionalmente sobre superficies utilizando dos máquinas de motilidad que se ensamblan en el polo principal11,18,19. En respuesta a la señalización del sistema quimiosensorial Frz, las células invierten la dirección del movimiento20. Durante las inversiones, las células invierten su polaridad y el polo en el que se ensamblan las máquinas de motilidad cambia21,22. La motilidad y su regulación por el sistema Frz son esenciales para la morfogénesis multicelular con la formación de colonias depredadoras y cuerpos fructíferos llenos de esporas11,18,19. El MglA-GTP activo estimula el ensamblaje de las maquinarias de motilidad en el polo celular principal23,24,25. La polaridad frontal-trasera está regulada dinámicamente por dos módulos proteicos interconectados, es decir, el módulo de polaridad y el sistema quimiosensorial Frz, que en combinación generan un interruptor espacial19. El módulo de polaridad establece el eje de polaridad adelantado/retrasado y, además de MglA, comprende cuatro proteínas que también se localizan asimétricamente en los polos celulares (Fig. 1a). La proteína homodimérica del dominio de bloqueo MglB por sí sola tiene actividad GAP y, junto con su co-GAP RomY de baja afinidad, forma el complejo MglB/RomY con una actividad GAP aún mayor26,27,28. RomX por sí solo tiene actividad GEF y forma el complejo RomR/RomX con una actividad GEF aún mayor y también sirve como factor de reclutamiento polar para MglA-GTP29.

a Esquema de la localización de las proteínas de polaridad. T4P indica el polo líder. El tamaño del círculo indica la cantidad relativa de una proteína en un polo. Código de color como en la Fig. 1b. b Esquema de interacciones entre proteínas de polaridad. El cuadro discontinuo indica la retroalimentación positiva de RomR/MglB. c La localización polar de MglA, MglB y RomR depende de MglC. Todas las proteínas de fusión se sintetizaron a partir de su locus nativo. En los diagramas, los polos con la fracción polar de fluorescencia más alta y más baja se definen como polo 1 y polo 2, respectivamente. Círculos rellenos, fracción media de fluorescencia en cada polo. La dispersión de las mediciones unicelulares se representa mediante barras de error y elipses (líneas discontinuas de colores). Líneas discontinuas negras, líneas de simetría; Líneas discontinuas grises, guías que indican la fracción de fluorescencia polar total. Número de células analizadas (n), indicadas en las esquinas superiores derechas. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes; Se muestran los datos de un experimento. Los genotipos mglA, mglB, mglC y romR se indican con A, B, C y R, respectivamente. Esquemas a la derecha, efectos observados. d MglC-mVenus se localiza asimétrica y dinámicamente en los polos celulares. La fusión se sintetizó a partir del locus nativo. Se tomaron imágenes de las células a intervalos de 30 segundos. Se tomaron imágenes de 200 células en dos experimentos independientes; Se muestra una celda representativa. Barra de escala, 1μm. La localización polar de MglC depende parcialmente de MglB y fuertemente de RomR. Se realizaron experimentos y los datos se presentaron como en la Fig. 1c. f Cuantificación de la localización polar de MglC-mVenus, MglB-mCherry y RomR-mCherry en ausencia de MglA. Se realizaron experimentos y los datos se presentaron como en la Fig. 1c. g MglC es un componente de la retroalimentación positiva RomR/MglC/MglB (cuadro discontinuo). h. MglC es esencial para establecer la polaridad RomR correcta. Se tomaron imágenes de las células como en la Fig. 1d, y se determinaron las fracciones de células con el grupo más brillante en el polo principal o retrasado. Panel izquierdo, resumen de fracciones de células con patrón de localización indicado. El número total de células en tres experimentos independientes se indica en la parte superior. Panel derecho, cuantificación de la localización de RomR-mCherry en células en movimiento.

Los experimentos y los modelos matemáticos han descubierto un intrincado conjunto de interacciones regulatorias entre las proteínas del módulo de polaridad17,26,27,28,29,30,31,32 (Fig. 1b). El andamio RomR está en la base de la localización polar de todas las demás proteínas de polaridad y también refuerza su propia localización polar, estableciendo así una retroalimentación positiva17. RomR también participa en una retroalimentación positiva con MglB mediante un mecanismo desconocido17. Además, RomR recluta directamente a RomX para formar el complejo RomR/RomX GEF29. Las altas concentraciones de MglB polar estimulan el reclutamiento polar de su compañero de interacción de baja afinidad RomY28. En el nodo RomR de la retroalimentación positiva RomR/MglB, RomR/RomX promueve el reclutamiento polar de MglA-GTP (Fig. 1b – conector de RomR/RomX a MglA)29, y en el nodo MglB, MglB/RomY inhibe el polar MglA-GTP. reclutamiento (Fig. 1b – conector de MglB/RomY a MglA)26,27,28. Finalmente, MglA-GTP interrumpe la retroalimentación positiva de RomR/MglB mediante un mecanismo desconocido (Fig. 1b – conector de MglA al cuadro discontinuo)17. Se ha sugerido que estas interacciones juntas dan como resultado las propiedades emergentes del sistema (Fig. 1a, b)17,28. Brevemente, en el polo con la concentración más alta de RomR, la retroalimentación positiva de RomR/MglB establece un polo con altas concentraciones de RomR/RomX y MglB/RomY. Debido a la presencia del complejo MglB/RomY, la actividad GAP domina sobre la actividad GEF en este polo, inhibiendo así el reclutamiento de MglA-GTP, y este polo se convierte en el polo rezagado. En el polo opuesto, la actividad RomR/RomX GEF domina sobre la actividad GAP porque la baja concentración de MglB es insuficiente para reclutar RomY28. En consecuencia, MglA-GTP es reclutado en este polo y participa en la retroalimentación negativa para inhibir la retroalimentación positiva de RomR/MglB, asegurando así la baja concentración de los otros reguladores de polaridad. El sistema Frz es el segundo módulo del interruptor de palanca espacial y el módulo de polaridad es el objetivo posterior de este sistema. La señalización Frz provoca la inversión de polaridad de las proteínas del módulo de polaridad por un mecanismo desconocido, sentando así las bases para el ensamblaje de las maquinarias de motilidad en el nuevo polo conductor30,31,33,34.

Entre las interacciones de las proteínas del módulo de polaridad, la retroalimentación positiva de RomR sobre sí misma, la retroalimentación positiva de RomR/MglB y el efecto inhibidor de MglA-GTP sobre esta retroalimentación positiva no se conocen bien. MglC también es una proteína de dominio de bloqueo homodimérica35,36,37 y participa en la regulación de la polaridad celular mediante un mecanismo desconocido36. Debido a que MglC interactúa con RomR y MglB35,36, MglC era candidato para actuar en la retroalimentación positiva de RomR/MglB.

Aquí, mostramos que MglC forma un complejo con RomR y MglB, estableciendo así una retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB y que MglA-GTP inhibe esta retroalimentación positiva al romper la interacción entre las proteínas del dominio de bloqueo de MglC y MglB. Además, demostramos que la retroalimentación positiva RomR/MglC/MglB sienta las bases para la polaridad conmutable.

Para investigar la función de MglC en la polaridad, recaracterizamos los defectos de motilidad de un mutante con una eliminación en marco de mglC (ΔmglC). De acuerdo con hallazgos anteriores, el mutante ΔmglC tiene defectos tanto en el deslizamiento como en la motilidad dependiente de T4P en ensayos de motilidad basados ​​en la población, y la expresión ectópica de mglC complementó estos defectos (Figuras complementarias 1a, b). En ensayos de motilidad basados ​​en células individuales (Figura 1c complementaria), y de acuerdo con observaciones anteriores, las células ΔmglC se movieron con la misma velocidad que las de tipo salvaje (WT) para ambos sistemas de motilidad; sin embargo, de manera similar al control negativo ΔfrzE que carece de la quinasa FrzE, las células ΔmglC tuvieron una frecuencia de reversión significativamente menor que las WT.

Para discriminar si el mutante ΔmglC no responde o tiene una sensibilidad reducida a la señalización de Frz, tratamos las células WT y ΔmglC con alcohol isoamílico de cadena corta (IAA) que estimula altamente las reversiones de una manera dependiente de FrzE. WT y el mutante ΔmglC respondieron de manera similar a IAA al 0,3% con la formación de colonias que tenían bordes lisos y sin llamaradas visibles en agar al 0,5%, que es óptimo para la motilidad dependiente de T4P, y pocas células individuales en el borde en agar al 1,5%. que es óptimo para la motilidad de deslizamiento (Figura complementaria 1a). Estos bordes de colonia suaves indican una alta frecuencia de reversión20,39. Concluimos que el mutante ΔmglC no tiene un defecto en la motilidad per se, sino una sensibilidad reducida a la señalización de Frz, lo que resulta en una frecuencia de inversión reducida.

Debido a que el módulo de polaridad es el objetivo aguas abajo del sistema Frz, cuantificamos la localización polar de fusiones activas marcadas fluorescentemente de las proteínas de polaridad en ausencia de MglC. Debido a que la localización de RomX sigue a la de RomR29 y la localización de RomY sigue a la concentración más alta de MglB28, utilizamos la localización de RomR y MglB como lecturas para la localización del complejo RomR/RomX y el complejo MglB/RomY, respectivamente.

En instantáneas de células ΔmglC (Fig. 1c), la localización polar de MglA-mVenus y MglB-mCherry se redujo fuertemente, mientras que la localización polar de RomR-mCherry se perdió solo parcialmente. MglA, MglB y RomR se acumularon independientemente de MglC (Figura complementaria 1d).

Para estudiar la localización de MglC, primero observamos que una fusión MglC-mVenus completamente activa expresada desde el sitio nativo (Figuras complementarias 1a, b) se localizaba en un patrón asimétrico bipolar con un gran grupo en el polo retrasado en las células WT y cambiaba de polaridad durante reversiones (Fig. 1d). El patrón asimétrico bipolar también fue evidente en las instantáneas (Fig. 1e). En ausencia de MglA, MglC-mVenus era más polar (Fig. 1e). Sin embargo, en ausencia de MglB, la localización polar de MglC-mVenus se perdió parcialmente; y, en ausencia de RomR, se perdió casi por completo (Fig. 1e). MglC-mVenus se acumuló independientemente de MglA, MglB y RomR (Figura complementaria 1e). Por tanto, MglA inhibe la localización polar de MglC, mientras que MglC depende parcialmente de MglB y fuertemente de RomR. En particular, en ausencia de RomR, MglB no admite una localización polar significativa de MglC.

Debido a que la interpretación de los resultados para la localización polar de MglC, MglB y RomR puede ser un desafío debido al efecto inhibidor de MglA-GTP sobre la retroalimentación positiva de RomR/MglB, cuantificamos su fluorescencia polar en cepas que carecen de MglA.

La localización polar de MglC-mVenus en el mutante ΔmglAΔmglB se perdió parcialmente en comparación con el mutante ΔmglA, se abolió casi por completo en el mutante ΔmglAΔromR y se abolió por completo en el mutante triple ΔmglAΔmglBΔromR (Fig. 1f). Estas observaciones confirman que la localización polar de MglC-mVenus depende parcialmente de MglB y fuertemente de RomR. También confirman que, en ausencia de RomR, MglB no admite significativamente la localización polar de MglC.

La localización polar de MglB-mCherry en los mutantes ΔmglAΔmglC, ΔmglAΔromR y ΔmglAΔmglCΔromR se perdió casi por completo (Fig. 1f). Estos resultados confirman que la localización polar de MglB-mCherry depende en gran medida de MglC y, como se mostró anteriormente17, de RomR. Además, ni MglC ni RomR por sí solos pueden establecer una localización polar eficiente de MglB-mCherry.

La localización polar de RomR-mCherry se abolió parcialmente en los mutantes ΔmglAΔmglB, ΔmglAΔmglC y ΔmglAΔmglBΔmglC (Fig. 1f). Por lo tanto, tanto MglB como MglC son importantes pero no esenciales para la localización polar de RomR. Además, sólo cuando MglB y MglC están presentes pueden estimular aún más la localización polar de RomR.

Estas observaciones demuestran que RomR por sí solo se localiza polarmente y respaldan que RomR recluta a MglC, que luego recluta a MglB. Las observaciones de que (1) MglB estimula la localización polar de MglC en presencia de RomR, y (2) MglB junto con MglC estimula la localización polar de RomR, respaldan que las tres proteínas establecen una retroalimentación positiva que refuerza su localización polar (Fig. 1g). Estas observaciones también sugieren que la retroalimentación positiva de RomR/MglB previamente establecida depende de MglC, es decir, MglC ayuda a generar una retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB actuando entre RomR y MglB (Fig. 1g). Debido a que MglA inhibe la retroalimentación positiva de RomR / MglB, este modelo también explica la observación de que MglA inhibe la localización polar de MglC (Fig. 1e). Además, la localización polar reducida de MglA en ausencia de MglC (Fig. 1c) es un resultado directo de la localización polar reducida de RomR en ausencia de MglC (Fig. 1c, f).

Para probar aún más la idea de la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB, aprovechamos un enfoque establecido para monitorear el reclutamiento polar cooperativo de RomR-mCherry17. En este enfoque, un promotor inducible por vainilla impulsa la expresión de romR-mCherry; tras la inducción, la localización polar de RomR-mCherry es seguida por microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Para monitorear la síntesis de RomR-mCherry a lo largo del tiempo, estimamos la concentración de RomR-mCherry en células individuales, denominada concentración de fluorescencia, midiendo la fluorescencia celular total y luego normalizando por área celular, que utilizamos como indicador del volumen celular.

Tras la inducción de la expresión de romR-mCherry en el mutante cuádruple ΔmglAΔmglBΔromRΔmglC (Fig. 2a complementaria) y el mutante triple ΔmglAΔromRΔmglC (Fig. 2b complementaria), RomR-mCherry se localizó asimétricamente en los polos en todas las concentraciones de fluorescencia y siguió cuantitativamente el patrón observado previamente en el triple mutante ΔmglAΔmglBΔromR (Figura complementaria 2c). Como se describe 17, las observaciones de que las fracciones de RomR-mCherry en ambos polos aumentan con la concentración de fluorescencia en niveles bajos de inducción proporcionan evidencia de cooperatividad positiva en la localización polar de RomR-mCherry (Figuras complementarias 2a-d). Debido a que la localización polar de RomR-mCherry es cuantitativamente similar en estas tres cepas, concluimos que MglC, similar a MglB, no es esencial para la retroalimentación positiva de RomR sobre sí mismo. Por el contrario, en el doble mutante ΔmglAΔromR, la localización polar de RomR-mCherry aumentó y fue más asimétrica, y el polo más brillante representó una fracción mayor de la fluorescencia de RomR-mCherry (Figura complementaria 2d). Esta observación confirma que MglC es esencial para establecer la retroalimentación positiva de RomR/MglB y que la retroalimentación positiva de RomR/MglB es, de hecho, una retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB (Fig. 1g).

El modelo para el establecimiento de la polaridad (Fig. 1g) predice que en ausencia de MglC y, por lo tanto, la retroalimentación positiva de RomR / MglC / MglB, el RomR polar residual, junto con RomX, reclutará MglA-GTP. Como resultado, MglA-GTP y RomR/RomX tendrán su fluorescencia polar más alta en el polo principal. Para probar esta predicción, realizamos microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo de células en movimiento. En WT, MglA-mVenus se localizó con un grupo grande en el polo principal y RomR-mCherry con un grupo grande en el polo rezagado en la mayoría de las células (Fig. 1h). Es importante destacar que, y como se predijo, en el mutante ΔmglC, MglA-mVenus y RomR-mCherry tuvieron su fluorescencia polar más alta en el polo principal en la mayoría de las células (Fig. 1h). Concluimos que MglC es importante no solo para la localización polar de MglA, MglB y RomR sino también para establecer la polaridad correcta de RomR-mCherry.

Para investigar el mecanismo subyacente a la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB, probamos las interacciones directas entre RomR, MglC, MglB y MglA mediante experimentos desplegables in vitro con proteínas purificadas. De acuerdo con observaciones previas en experimentos de extracción in vitro35 y ensayos de dos híbridos basados ​​en adenilato ciclasa bacteriana (BACTH)36, Strep-MglC derribó His6-MglB y MalE-RomR en combinaciones de pares, pero no MglA-His6 precargado con GTP (Fig. 2a; Fig. Suplementaria 3a). En combinaciones por pares utilizando MalE-RomR como cebo, MalE-RomR derribó Strep-MglC pero no His6-MglB; en particular, en presencia de las tres proteínas, RomR-MalE eliminó Strep-MglC así como His6-MglB (Fig. 2b; Fig. complementaria 3b). Finalmente, en combinaciones de pares, His6-MglB eliminó Strep-MglC pero no MalE-RomR; sin embargo, en presencia de las tres proteínas, His6-MglB eliminó Strep-MglC y MalE-RomR (Fig. 2c; Fig. complementaria 3c).

Las proteínas a – c se mezclaron en concentraciones finales de 10 µM y se aplicaron a las matrices indicadas. Se lavaron las matrices y se eluyeron las proteínas unidas. La proteína del cebo está indicada por el círculo negro. En experimentos con MglA-His6, la proteína se cargó previamente con GTP y todos los tampones contenían GTP 40 µM. Se separaron volúmenes equivalentes de la carga (L), el último lavado (W) y el eluato (E) en el mismo gel SDS-PAGE y se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue. El espacio entre carriles indica carriles eliminados para fines de presentación. Las masas moleculares calculadas de las proteínas indicadas se indican a la derecha y los marcadores de peso molecular (M) a la izquierda. En los esquemas de la derecha, una interacción directa con el cebo se indica con un color negro y una interacción indirecta con una flecha discontinua. Para muestras con MalE-RomR, las proteínas que migran más rápido son productos de degradación. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes.

A continuación, determinamos si MglC y/o RomR/MglC tienen actividad MglA GAP o interfieren con la actividad MglB y/o MglB/RomY GAP. Para ello, determinamos la actividad de MglA-His6 GTPasa en presencia de RomR, MglC, MglB y/o RomY. Ni Strep-MglC ni MalE-RomR/Strep-MglC afectaron la actividad de MglA GTPasa en presencia o ausencia de MglB-His6 y/o Strep-RomY (Figura complementaria 4).

Concluimos que RomR, MglC y MglB interactúan para formar un complejo en el que MglC se intercala entre RomR y MglB.

Para dilucidar la base estructural de las interacciones RomR → MglC → MglB, aprovechamos la información estructural para MglA, MglB y MglC35,40,41,42. Cada protómero MglB en el homodímero consta de una lámina β de cinco cadenas intercalada entre la hélice α2 y las hélices α1/α340. En el dímero, las hélices α2 generan el llamado lado de dos hélices y los pares de hélices α1/α3 el llamado lado de cuatro hélices (Fig. 3a). En la estructura cristalográfica del complejo MglA-GTPɣS:MglB2, el monómero MglA interactúa asimétricamente con el lado de dos hélices del dímero MglB40,41,42.

a Estructura cristalográfica del dímero MglB (pdb ID: 6hjm40) vista desde los lados de dos y cuatro hélices. Paneles inferiores, representación de la superficie del dímero MglB basada en el potencial de superficie electrostático contorneado de +5 a −5 kT e−1. Los residuos K14, R115 y K120 se indican en rojo en el lado de las cuatro hélices y las correspondientes regiones superficiales cargadas positivamente mediante círculos negros en los diagramas de potencial superficial electrostático. b La variante MglBKRK no interactúa con MglC. El experimento de extracción se realizó con His6-MglBKRK como cebo en la resina indicada y los datos se presentaron como en la Fig. 2. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes. C. MglBKRK-mCherry tiene una localización polar reducida. A modo de comparación, se incluye MglBWT-mCherry (punto rojo). MglBKRK-mCherry se sintetizó a partir del locus nativo. d MglBKRK provoca una localización polar reducida de MglA, MglC y RomR. A modo de comparación, la localización de las tres proteínas de fusión se incluye en presencia de MglBWT (puntos amarillos, marrones y verdes). MglBKRK se sintetizó a partir del locus nativo. En c – d, se realizaron experimentos y los datos se presentaron como en la Fig. 1c.

Galicia et al. informaron que los residuos K14, R115, K120 en MglB están altamente conservados en homólogos de MglB, expuestos en la superficie en la estructura resuelta del dímero de MglB generando dos regiones superficiales cargadas positivamente en el lado de cuatro hélices del dímero de MglB40 (Fig. 3a) . Además, informaron que la variante MglBK14A R115A K120A (en adelante, MglBKRK) con sustituciones de estos tres residuos cargados positivamente en Ala todavía tiene actividad GAP in vitro pero se localiza de manera difusa in vivo mediante un mecanismo desconocido40. Debido a que MglB se localiza de manera difusa en ausencia de MglC, por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las regiones superficiales cargadas positivamente en el dímero de MglB definido por los residuos K14, R115, K120 podrían estar involucradas en la interacción entre MglB y MglC.

En experimentos desplegables in vitro, His6-MglBKRK no se unió de manera detectable a Strep-MglC (Fig. 3b). Consistentemente, la localización polar de MglBKRK-mCherry en células WT se redujo fuertemente independientemente de la presencia o ausencia de MglC y MglA (Fig. 3c; Fig. Suplementaria 5a). En el experimento inverso, MglBKRK provocó una fuerte reducción en la localización de MglA-mVenus, mientras que la localización polar de MglC-mVenus y RomR-mCherry se eliminó parcialmente (Fig. 3d; Fig. Suplementaria 5a). Concluimos que MglBKRK es deficiente en la interacción con MglC y sugerimos que las regiones superficiales de KRK cargadas positivamente en el dímero de MglB representan la interfaz con MglC, de acuerdo con la sugerencia de Kapoor et al.35. Además, sugerimos que el efecto de la variante MglBKRK en la localización de RomR y MglA es causado por la interrupción de la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB, lo que resulta en una localización polar reducida de RomR/RomX y, en consecuencia, una localización polar reducida de MglA.

La estructura del homodímero MglC es similar a la del MglB con lados de dos y cuatro hélices (Fig. 4a) 35. McLoon y cols. informaron que los residuos F25, D26, I28 en MglC están altamente conservados en homólogos de MglC36 (Figura complementaria 6). En la estructura resuelta del dímero MglC, estos tres residuos están expuestos en la superficie y generan dos regiones superficiales separadas con carga negativa en el lado de las dos hélices (Fig. 4a). McLoon y cols. También informaron que la variante MglCF25A D26A I28A (en adelante, MglCFDI) con sustituciones de estos tres residuos en Ala fue abolida en su interacción con MglB pero no con RomR según los ensayos BACTH36. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las dos regiones superficiales cargadas negativamente definidas por los residuos F25, D26, I28 podrían representar la interfaz de interacción de MglC a MglB.

a Estructura cristalográfica del dímero MglC (pdb ID: 7CY135) vista desde los lados de dos y cuatro hélices. Paneles inferiores, representación de la superficie del dímero de MglC basada en el potencial de superficie electrostático contorneado de +5 a −5 kT e−1. Los residuos F25, D26, I28 y los residuos K104, R106, R110 se indican en rojo en los lados de dos y cuatro hélices, respectivamente, y las correspondientes regiones superficiales cargadas negativa y positivamente se indican mediante círculos negros en la superficie electrostática. diagramas de potencial. b MglCFDI-mVenus tiene una localización polar reducida. A modo de comparación, se incluye MglCWT-mVenus (punto marrón). MglCFDI-mVenus se sintetizó a partir del locus nativo. c MglCFDI provoca una localización polar reducida de MglA, MglB y RomR. A modo de comparación, la localización de las tres proteínas de fusión se incluye en presencia de MglCWT (puntos amarillos, rojos y verdes). MglCFDI se sintetizó ectópicamente. d MglCKRR-mVenus ha reducido fuertemente la localización polar. A modo de comparación, se incluye MglCWT-mVenus (punto marrón). MglCKRR-mVenus se sintetizó a partir del locus nativo. e MglCKRR provoca una localización polar reducida de MglA, MglB y RomR. A modo de comparación, la localización de las tres proteínas de fusión se incluye en presencia de MglCWT (puntos amarillos, rojos y verdes). MglCKRR se sintetizó ectópicamente. En be, se realizaron experimentos y los datos se presentaron como en la Fig. 1c.

Inicialmente buscamos verificar el efecto de la variante MglCFDI sobre la interacción MglC/MglB in vitro; sin embargo, la variante marcada con Strep formó cuerpos de inclusión en Escherichia coli en todas las condiciones analizadas, lo que impidió su purificación. Es importante destacar que en M. xanthus, MglCFDI-mVenus era soluble (Figura complementaria 5b); sin embargo, se acumuló a un nivel reducido en comparación con MglC-mVenus (Figura complementaria 5c). La localización polar de MglCFDI-mVenus en células WT se perdió parcialmente en comparación con MglC-mVenus (Fig. 4b). Además, la localización polar de MglCFDI-mVenus no cambió mucho tras la eliminación de MglA o MglB, pero se eliminó mediante la eliminación de RomR (Fig. 4b). En el experimento inverso, MglCFDI se acumuló como MglC y, similar a la mutación ΔmglC, causó fuertes reducciones en la localización polar de MglA-mVenus y MglB-mCherry, mientras que la localización polar de RomR-mCherry se eliminó solo parcialmente (Fig. 4c; Fig. complementaria 5c). . Concluimos que MglCFDI es deficiente en la interacción con MglB pero no con RomR y sugerimos que las regiones superficiales de FDI cargadas negativamente en el dímero de MglC representan la interfaz con MglB. Además, sugerimos que el efecto de la variante MglCFDI en la localización de RomR y MglA es causado por la interrupción de la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB, lo que resulta en una localización polar reducida de RomR/RomX y, en consecuencia, una localización polar reducida de MglA, como se observa. en el mutante ΔmglC.

Además de los residuos de FDI, los residuos K104, R106, R110 (numeración de MglC) están altamente conservados en homólogos de MglC (Figura complementaria 6). En la estructura resuelta del dímero MglC, estos tres residuos están expuestos en la superficie en el lado de las cuatro hélices y definen una región continua, cargada positivamente y expuesta en la superficie en el dímero (Fig. 4a). Debido a que esta región está separada de las regiones FDI y MglC interactúa con MglB y RomR en paralelo, planteamos la hipótesis de que la región superficial cargada positivamente definida por los residuos K104, R106, R110 podría representar la interfaz de interacción de MglC con RomR.

Para ello, generamos variantes MglCK104A R106A R110A (en adelante, MglCKRR). Sin embargo, la variante marcada con Strep formó cuerpos de inclusión en E. coli en todas las condiciones analizadas, lo que impidió su purificación. Es importante destacar que en M. xanthus, MglCKRR-mVenus era soluble (Figura complementaria 5b) y se acumuló al mismo nivel que MglC-mVenus (Figura complementaria 5d). La localización polar de MglCKRR-mVenus en células WT se redujo fuertemente en comparación con MglC-mVenus (Fig. 4d) y permaneció fuertemente reducida tras la eliminación de MglA, MglB o RomR (Fig. 4d). En el experimento inverso, MglCKRR se acumuló como MglC y, similar a la mutación ΔmglC y MglCFDI, causó fuertes reducciones en la localización polar de MglA-mVenus y MglB-mCherry, mientras que la localización polar de RomR-mCherry solo se eliminó parcialmente (Fig. 4e; Fig. Suplementaria. 5d). Con base en estas observaciones, llegamos a la conclusión de que MglCKRR es deficiente en la interacción con RomR y sugerimos que las dos regiones superficiales de KRR cargadas positivamente en el dímero de MglC representan la interfaz con RomR. Además, sugerimos que el efecto de la variante MglCKRR sobre la localización de MglA es causado por la interrupción de la retroalimentación positiva RomR/MglC/MglB, como se observa en los mutantes ΔmglC y mglCFDI.

Los homólogos de RomR comprenden un dominio receptor N-terminal de reguladores de respuesta, una región intrínsecamente desordenada (IDR) y una región rica en Glu con carga negativa y helicoidal α en el extremo C (en adelante, RomRC) (Fig. 5a) 30. En los ensayos BACTH, RomRC interactúa con MglC36. Para examinar si RomRC es la única interfaz para MglC, generamos una variante RomR1–368 que carece de RomRC y una variante que solo contiene RomRC.

a Arquitectura de dominio y puntuación de carga de RomR. La puntuación de carga se calculó utilizando una ventana deslizante de 20 residuos. b Análisis MP de MalE-RomR, MalE-RomR1-368 y MalE-RomRC. Las masas moleculares correspondientes a los respectivos ajustes gaussianos se muestran en kDa encima de las curvas ajustadas. Las masas moleculares calculadas de las variantes monoméricas, diméricas y triméricas de MalE-RomR se indican entre paréntesis junto con los símbolos de los estados oligoméricos. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. c RomRC interactúa con MglC mientras que RomR1–368 no lo hace. El experimento de extracción se realizó con Strep-MglC como cebo en la resina indicada y se presentó como en la Fig. 2. Las múltiples bandas debajo de MalE-RomRC y MalE-RomR1–368 son productos de degradación. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. d RomR1–368-mCherry ha reducido fuertemente la localización polar. A modo de comparación, se incluye RomRWT-mCherry (punto verde). RomR1–368-mCherry se sintetizó a partir del locus nativo. Las causas de RomR1–368 reducen fuertemente la localización polar de MglA, MglB y MglC. A modo de comparación, la localización de las tres proteínas de fusión se incluye en presencia de RomRWT (puntos amarillos, rojos y marrones). RomR1–368 se sintetizó a partir del locus nativo. f RomRC-mCherry localiza polarmente. A modo de comparación, se incluye RomRWT-mCherry (punto verde). RomRC-mCherry se sintetizó ectópicamente. En df, se realizaron experimentos y los datos se presentaron como en la Fig. 1c.

Primero, utilizando fotometría de masas (MP), investigamos la estructura oligomérica de RomR. Detectamos MalE-RomR con masas que coinciden bien con monómeros, dímeros y trímeros (Fig. 5b). MalE-RomRC también se detectó con masas que coincidían bien con monómeros, dímeros y trímeros, mientras que MalE-RomR1–368 solo se detectó en masas que coincidían con monómeros (Fig. 5b). El MalE-RomR trimérico fue más frecuente a 50 nM en comparación con 25 nM, mientras que el MalE-RomRC trimérico estuvo igualmente presente a 25 nM y 50 nM (Fig. 5b). Concluimos que RomRC es necesario y suficiente para la oligomerización de RomR y que los dominios receptores y los IDR no interactúan. Además, estos resultados respaldan que RomR se forma hasta trímeros y RomR de longitud completa comienza a disociarse en dímeros por debajo de 50 nM. Según el análisis de inmunotransferencia cuantitativa, una célula de M. xanthus contiene ~ 6000 ± 2000 moléculas de RomR (Fig. 5e complementaria), lo que da como resultado una concentración de RomR celular de ~ 2,5 ± 0,8 µM. Por lo tanto, sugerimos que RomR esté presente predominantemente como trímero in vivo.

En experimentos desplegables, MalE-RomR1–368 no interactuó de manera detectable con Strep-MglC, mientras que MalE-RomRC sí lo hizo (Fig. 5c). En M. xanthus, RomR1–368-mCherry se acumuló al mismo nivel que RomR-mCherry (Fig. 5f complementaria), sin embargo, se abolió la localización polar en células WT (Fig. 5d). En el experimento inverso, RomR1–368 se acumuló como RomR y, similar a la mutación ΔromR, causó fuertes reducciones en la localización polar de MglA-mVenus, MglB-mCherry y MglC-mVenus (Fig. 5e17,30,31; Fig. complementaria. 5f). RomRC-mCherry, incluso cuando se expresa a partir del fuerte promotor pilA, se acumuló en un nivel muy reducido (Figura complementaria 5f); Es importante destacar que la mayoría de las células tenían una señal polar débil (Fig. 5f).

Concluimos que el RomRC cargado negativamente tiene tres funciones: es necesario y suficiente para la oligomerización de RomR, representa la interfaz de RomR para MglC y es necesario y al menos parcialmente responsable de la localización polar de RomR.

Para obtener información estructural sobre el complejo RomR/MglC/MglB, utilizamos información estructural35,40,41, nuestros datos funcionales y predicciones estructurales AlphaFold-Multimer43,44,45 para modelar este complejo. Los modelos AlphaFold-Multimer de los dímeros MglB y MglC se predijeron con alta confianza y coincidieron bien con las estructuras cristalográficas resueltas de los dímeros MglB y MglC (Figuras complementarias 7a-c), lo que documenta la validez de las predicciones estructurales.

Una estructura de baja resolución del complejo MglC/MglB respalda que un dímero de MglC se une a dos dímeros de MglB35. En los modelos AlphaFold-Multimer con la misma estequiometría, se predice con alta precisión que dos dímeros de MglB interactuarán utilizando sus lados de cuatro hélices con los bordes "laterales" del lado de dos hélices del dímero de MglC dando lugar a un MglC2:(MglB2 )2 complejo (Fig. 6a; Fig. complementaria 7d). En este complejo, los análisis basados ​​en Pymol respaldan que los residuos R115 en las dos regiones KRK de un dímero MglB están muy cerca y participan en el establecimiento de contacto con D26 e I28 de una región FDI de MglC (Fig. 6a, recuadro). Por lo tanto, este modelo estructural concuerda con una estequiometría 2:4 del complejo MglC/MglB y, junto con nuestros hallazgos experimentales, respaldan que las regiones de superficie MglB KRK y MglC FDI con carga opuesta interactúan. Observamos que los dímeros de MglB unidos a MglC son estructuralmente diferentes en comparación con el dímero de MglB de forma aislada, es decir, el lado de cuatro hélices está en un estado más cerrado cuando forma un complejo con MglC2 (Figura complementaria 7e). Por otro lado, el dímero MglC unido a MglB solo tiene diferencias estructurales menores en comparación con el dímero aislado (Figura complementaria 7f).

un modelo estructural AlphaFold-Multimer del complejo MglC2:(MglB2)2. Se muestra el modelo de rango 1. El recuadro muestra R115 en cada uno de los protómeros de MglB junto con los residuos D26 e I28 en un protómero de MglC. b Análisis MP de MalE-MglC (arriba) y mezclas de MglC con MalE-RomR o MalE-RomRC. Las masas moleculares correspondientes a los respectivos ajustes gaussianos se muestran en kDa encima de las curvas ajustadas. Los ajustes gaussianos están coloreados según las proteínas respectivas MalE-MglC (marrón), MalE-RomR (verde), MalE-RomRC (verde), MalE-RomR:MalE-MglC (púrpura) y MalE-RomRC:MalE-MglC (púrpura). ). El ajuste gaussiano azul (panel inferior) indica una mezcla de MalE-MglC y MalE-RomRC. En paréntesis junto con los símbolos de los estados oligoméricos. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. c Esquema del complejo RomR/MglC/MglB con una estequiometría 3:2:4. d Medición de la cinética de recuperación in vivo de grupos polares de RomR-mCherry en experimentos FRAP. En el panel superior, el círculo blanco indica la región de interés (ROI) blanqueada en un polo retrasado y la línea punteada el evento de blanqueamiento. En el panel inferior, la intensidad de fluorescencia normalizada del ROI antes del blanqueo se estableció en 1,0. Los puntos de colores indican las barras de media y error STDEV. Las líneas oscuras muestran la recuperación ajustada a una única exponencial. n, número de eventos de blanqueo en un polo rezagado. Barra de escala, 2μm. e Resumen de T1/2 y Fmob. Las células se trataron como en d con blanqueamiento de grupos en el polo retrasado (Lag) o delantero (Lead). El número total de eventos de blanqueo en tres réplicas biológicas se enumera arriba. Barras de error, media ± STDEV. *P < 0,05, ns, prueba t de Student bilateral sin diferencias significativas. Los valores P exactos se enumeran en el archivo de datos de origen.

Para determinar la estequiometría del complejo RomR/MglC utilizamos MP. Detectamos una proteína de fusión MalE-MglC con masas que coinciden con un monómero y un dímero (Fig. 6b). En presencia de MalE-MglC y MalE-RomR, detectamos, además de las masas de las proteínas individuales, complejos con masas consistentes con una estequiometría RomR: MglC de 2: 2 y 3: 2 (Fig. 6b; ver también figura 5b). De manera similar, en presencia de MalE-MglC y MalE-RomRC, detectamos picos adicionales con masas consistentes con una estequiometría RomRC: MglC de 2: 2 y 3: 2 (Fig. 6b; ver también Fig. 5b).

Para obtener información estructural sobre los complejos RomR/MglC, intentamos generar modelos estructurales AlphaFold-Multimer de RomR dimérico y trimérico, RomRC dimérico y trimérico, RomR2:MglC2 y RomR3:MglC2, así como complejos RomRC2:MglC2 y RomRC3:MglC2. . Sin embargo, ninguno de estos complejos se predijo con gran confianza. En conjunto, nuestros datos experimentales respaldan que el dímero MglC puede interactuar con RomR dimérico y trimérico y que la interfaz entre MglC y RomR está representada por las regiones KRR con carga opuesta en el dímero MglC y la RomRC con carga negativa en el dímero y trímero RomR.

En total, estos datos respaldan que un solo dímero MglC está intercalado entre dos dímeros MglB y un dímero o trímero RomR, dando lugar a un complejo RomR:MglC:MglB con una estequiometría 2:2:4 o 3:2:4. Debido a que el análisis cuantitativo de inmunotransferencia (Fig. 5e complementaria) respalda que RomR está presente predominantemente como un trímero in vivo, sugerimos que la forma dominante del complejo RomR: MglC: MglB in vivo tiene una estequiometría 3: 2: 4 (Fig. 6c ).

El modelo estructural del complejo RomR/MglC/MglB respalda un modelo de cómo interactúan RomR, MglC y MglB y cómo RomR polar recluta MglC, que recluta a MglB. Sin embargo, a partir de este modelo, no está claro cómo se cierra la retroalimentación positiva RomR/MglC/MglB. Especulamos que este circuito podría cerrarse si RomR se uniera de manera más estable a los polos en el complejo RomR/MglC/MglB en comparación con RomR solo. Para obtener una métrica para la estabilidad de RomR en grupos polares, utilizamos experimentos de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) en los que se blanquearon los grupos polares de RomR-mCherry y se redujo el tiempo de recuperación máximo (T1/2) y la fracción móvil (Fmob). utilizado para evaluar la rotación de RomR-mCherry. En WT, RomR-mCherry en el polo retrasado/principal se intercambió dinámicamente con el citoplasma con T1/2 de 25,7 ± 15,2/17,3 ± 8,6 s, similar a resultados anteriores34, y Fmob de 0,7 ± 0,1/0,9 ± 0,1 (Fig. 6d). , mi). Por lo tanto, la rotación de RomR-mCherry es significativamente más lenta y menor en el polo rezagado que en el polo líder. Estas observaciones concuerdan con que MglA-GTP en el polo principal participa en una retroalimentación negativa para inhibir la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB. Consistentemente, en el mutante ΔmglA no móvil en el que no se pueden distinguir los polos delantero y trasero, T1/2 aumentó y Fmob disminuyó en comparación con el polo principal en WT (Fig. 6e). Es importante destacar que en las células ΔmglB y ΔmglC, T1/2 y Fmob de RomR-mCherry en los dos polos fueron similares, y los valores de T1/2 fueron significativamente más bajos y los valores de Fmob significativamente más altos que en el polo retrasado en WT (Fig. 6e). .

Estas observaciones respaldan que MglB y MglC reducen conjuntamente el recambio polar de RomR-mCherry, lo que respalda que una unión polar más estable de RomR en presencia de MglC y MglB cierra la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB.

Para analizar cómo MglA-GTP inhibe la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB, planteamos la hipótesis de que MglA-GTP rompe la interacción entre RomR/MglC, MglC/MglB o ambos. Con este fin, realizamos experimentos desplegables con Strep-MglC como cebo. Strep-MglC derribó His6-MglB y MalE-RomR pero no MglA-His6 en presencia del análogo de GTP no hidrolizable GppNHp o GDP (Fig. 7a, b; Fig. complementaria 8a). Curiosamente, en presencia de MglA-His6 cargado con GppNHp, Strep-MglC ya no derribó His6-MglB, pero aún derribó His6-MglB en presencia de MglA-His6 cargado con GDP (Fig. 7a). Por el contrario, Strep-MglC eliminó MalE-RomR en presencia de MglA-His6 cargado con GppNHp o GDP (Fig. 7b). Concluimos que MglA-GTP rompe específicamente la interacción MglC/MglB pero no la interacción MglC/RomR. Esta observación también concuerda con que ni MglC ni RomR / MglC afectan la actividad de MglB y MglB / RomY GAP (Figura complementaria 4). Por lo tanto, la adición de MglA-GTP al complejo RomR/MglC/MglB da como resultado el secuestro de MglB por MglA-GTP, permitiendo así que continúe la actividad de MglB GAP.

a, b MglA-GTP rompe la interacción entre MglC y MglB. Se realizaron experimentos de extracción con Strep-MglC como cebo en la resina indicada como se describe en la Fig. 2. Se preincubó MglA-His6 con GppNHp o GDP (concentración final 40 µM). Todos los tampones contenían GppNHp o GDP 40 µM. En a, los geles de SDS-PAGE se sondaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos α-MglB. En b, las múltiples bandas debajo de MalE-RomR son productos de degradación. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. C. Estructura cristalográfica de MglA-GTPγS:MglB2 (gris/amarillo) (pdb ID: 6izw41) superpuesta al modelo AlphaFold-Multimer de un complejo MglC2:MglB2 (marrón/rojo). En el recuadro, R115 en cada uno de los protómeros MglB en el complejo MglA-GTPγS:MglB2 se muestra en amarillo y en rojo en el modelo MglC2:MglB2; D26 e I28 se muestran en marrón para uno de los protómeros de MglC. Las flechas indican el reposicionamiento de R115 en los dos complejos. Para simplificar, se muestra que el dímero MglC interactúa con un solo dímero MglB. d Esquema de la ruptura de la interacción MglB/MglC por MglA-GTP. Las flechas dobladas indican el cambio conformacional en los dímeros de MglB tras la unión de MglA-GTP. e Interacciones regulatorias que establecen y mantienen la polaridad anteroposterior en M. xanthus. f Diferentes interacciones entre las proteínas de polaridad dominan en los polos delantero y trasero en WT y el mutante ΔmglC. Las flechas completas muestran interacciones localmente fuertes, las flechas discontinuas muestran interacciones que están localmente suprimidas. La flecha de RomR sobre sí mismo indica la retroalimentación positiva que refuerza su localización polar, pero no se sabe cómo RomR se localiza polarmente. Código de color como en e.

Para comprender la base de la inhibición de MglA-GTP de la interacción MglC / MglB, comparamos la estructura resuelta de MglA-GTPɣS: MglB2 con el modelo MglC2: (MglB2) 2 AlphaFold-Multimer (Fig. 6a). Identificamos diferencias conformacionales significativas en los dímeros de MglB en los dos complejos. Específicamente, el lado de cuatro hélices de MglB2 está en un estado más abierto cuando forma un complejo con MglA-GTPɣS que con MglC2 (Fig. 7c). Como resultado, los dos residuos R115 en las regiones MglB KRK probablemente estén ubicados de tal manera en el complejo con MglA-GTPɣS que no pueden interactuar con D26 e I28 en la región MglC FDI (Fig. 7c, d; ver también Fig. .6a). Observamos que en la estructura resuelta del dímero MglB con MglA-GTPɣS, el lado de cuatro hélices está más abierto que en la estructura resuelta del dímero MglB de forma aislada (Figura complementaria 8b). Por lo tanto, estas estructuras resueltas junto con el modelo AlphaFold-Multimer del complejo MglC2:(MglB2)2 respaldan que el dímero MglB puede existir en tres estados conformacionales diferentes, donde el grado de "apertura" en el lado de las cuatro hélices varía (Suplementario). Figura 8c).

Aquí, identificamos a MglC como un componente crítico del módulo de polaridad para la polaridad delantera-trasera conmutable en M. xanthus. Demostramos que la retroalimentación positiva RomR/MglB propuesta previamente incorpora y depende de MglC. Estas tres proteínas forman un complejo heteromérico RomR/MglC/MglB en el que MglC está intercalado entre RomR y MglB. In vivo, establecen la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB que da como resultado la colocalización de RomR/RomX GEF y MglB/RomY GAP en altas concentraciones en el polo retrasado (Fig. 7e yf, panel superior). Además, demostramos que el efecto inhibidor previamente informado de MglA-GTP sobre la retroalimentación positiva de RomR/MglB es el resultado de que MglA-GTP rompe la interacción MglC/MglB sin interferir con la interacción RomR/MglC en el positivo de RomR/MglC/MglB. retroalimentación (Fig. 7e yf, panel superior). Mediante este efecto inhibidor, el MglA-GTP en el polo principal limita la acumulación de otros reguladores de polaridad en este polo. Al participar en estas interacciones, MglC estimula la localización polar de las proteínas de polaridad restantes y también es clave para permitir la inversión dinámica de la polaridad en respuesta a la señalización de Frz.

Las observaciones in vitro junto con un modelo estructural AlphaFold-Multimer del complejo MglC/MglB y experimentos in vivo, respaldan que el complejo RomR:MglC:MglB tiene una estequiometría 3:2:4 in vivo. Específicamente, nuestros datos respaldan que el RomRC α-helicoidal cargado negativamente interactúa con las dos regiones superficiales KRR yuxtapuestas con carga positiva en el dímero MglC, y que cada una de las dos regiones superficiales FDI cargadas negativamente en el dímero MglC interactúan con la superficie KRK cargada positivamente. Regiones en un dímero MglB. Estas interacciones entre regiones superficiales con cargas opuestas permiten que RomR polar reclute MglC, que recluta MglB. Los experimentos FRAP in vivo demostraron que MglC y MglB permiten una ocupación de RomR polar más estable. Con base en estos hallazgos, inferimos que la retroalimentación positiva de RomR / MglC / MglB para la localización polar implica el reclutamiento directo a través de las interacciones RomR → MglC → MglB. Estas interacciones estabilizan la unión polar de RomR, cerrando así la retroalimentación positiva. Debido a que ni RomR, MglC ni RomR/MglC tienen actividad GAP medible ni afectan de manera mensurable la actividad GAP de MglB/RomY y MglB, inferimos que una función de MglC es conectar MglB y RomR para establecer la retroalimentación positiva.

In vitro, MglA-GTP rompe la interacción MglC/MglB en el complejo RomR/MglC/MglB sin interferir con la interacción RomR/MglC. Una comparación de la estructura resuelta del complejo MglA-GTPγS:MglB2 con un modelo AlphaFold-Multimer del complejo MglC2:(MglB2)2 respalda que MglA-GTP rompe la interacción MglC/MglB utilizando un mecanismo alostérico. En este modelo, MglA-GTP al unirse al lado de dos hélices de un dímero MglB induce un cambio conformacional que altera el lado de cuatro hélices del dímero MglB, rompiendo así la interacción entre las interfaces MglC FDI y MglB KRK. Respaldando estas observaciones, RomR / MglC no afecta la actividad de MglB ni de MglB / RomY GAP (Figura complementaria 4). Por tanto, la segunda función de MglC es permitir el efecto inhibidor de MglA-GTP sobre la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB in vivo. En nuestro modelo, la alta concentración del complejo MglB/RomY GAP en el polo retrasado inhibe el reclutamiento de MglA-GTP en este polo al estimular la actividad MglA GTPasa. En este proceso, MglA-GTP rompe la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB, lo que resulta en el desprendimiento de MglB. Sin embargo, debido a la alta concentración de RomR y MglC en este polo, MglB será rápidamente recapturado para restaurar el complejo RomR/MglC/MglB. De acuerdo con esta noción, el MglB polar se intercambia rápidamente con el citoplasma con un T1/2 de ~6 segundos en experimentos FRAP34.

Nuestro estudio plantea varias preguntas intrigantes para futuras investigaciones sobre las proteínas del módulo de polaridad. Primero, RomRC tiene tres funciones: interactúa no solo con MglC sino que también media en la oligomerización con la formación de dímeros y trímeros y es necesario y al menos en parte responsable de la localización polar de RomR. La cuantificación in vivo de la concentración de RomR (Fig. 5e complementaria) sugiere que RomR trimérico es la forma predominante in vivo; sin embargo, aún queda por determinar cuál de las dos formas representa la forma activa. De manera similar, no se sabe cómo RomRC provoca la localización polar de RomR y cómo RomR estimula su unión polar. En segundo lugar, la evidencia experimental y los modelos estructurales AlphaFold-Multimer respaldan que MglB se une a su co-GAP RomY con baja afinidad en el lado de las dos hélices28. Por lo tanto, sugerimos que el complejo RomR/MglC/MglB en el polo retrasado también contiene RomY formando un complejo RomR/MglC/MglB/RomY. En tercer lugar, RomR interactúa con RomX para generar el complejo Rom/RomX GEF polarmente localizado. Si bien se desconocen los detalles estructurales de este complejo, plantean la posibilidad de que el complejo RomR/MglC/MglB también incluya RomX. Los complejos formados se abordarán en trabajos futuros.

El mutante ΔmglC se parece a WT en cuanto a la motilidad unidireccional, pero es menos sensible a la señalización de Frz, lo que respalda que la función final de MglC es establecer sensibilidad a la señalización de Frz, permitiendo así inversiones de polaridad. Los dos reguladores de respuesta de salida del sistema Frz, FrzX y FrzZ, actúan sobre el módulo de polaridad mediante mecanismos desconocidos para permitir inversiones de polaridad30,31,33,34. La observación de que el mutante ΔmglC todavía responde a altos niveles de señalización de Frz sostiene que MglC no es el objetivo molecular posterior del sistema Frz, pero permite la capacidad de respuesta de Frz mediante un mecanismo diferente. Como lo predice el modelo para el establecimiento de la polaridad (Fig. 7e, f, paneles superiores), ni la retroalimentación positiva de MglC ni de RomR / MglC / MglB son importantes para la localización de MglA en el polo principal. En cambio, en ausencia de MglC y, por lo tanto, de la retroalimentación positiva de RomR / MglC / MglB, la concentración polar más alta del complejo RomR / RomX se colocaliza con MglA en el polo principal (Fig. 7f, panel inferior). En el mutante ΔmglC, la localización polar de RomR / RomX y MglA es impulsada por RomR que estimula su propia unión polar en una retroalimentación positiva y luego recluta a RomX y MglA (Fig. 7f, panel inferior). Por lo tanto, en esta configuración, el módulo de polaridad es menos sensible al sistema Frz, mientras que la polaridad delantera-trasera se mantiene firmemente. Con base en argumentos teóricos, anteriormente argumentamos que la configuración con una alta concentración de RomR/RomX GEF en el polo retrasado permitiría la rápida acumulación de MglA-GTP en este polo en respuesta a la señalización de Frz, permitiendo la inversión de polaridad. Por lo tanto, sugerimos que la configuración espacial de las proteínas de polaridad en el mutante ΔmglC lo hace menos sensible a la señalización de Frz porque hay muy poca RomR/RomX GEF en el polo retrasado para reclutar MglA-GTP durante las reversiones. Por lo tanto, la retroalimentación positiva RomR/MglC/MglB que resulta en la peculiar colocalización de RomR/RomX GEF y MglB/RomY GAP en el polo rezagado en WT tiene dos propósitos: Primero, la actividad GAP desplaza MglA-GTP de este polo para permitir translocación unidireccional; y, en segundo lugar, la actividad del FMAM es necesaria para dotar al sistema de la capacidad de invertir la polaridad de forma rápida y eficiente. En otras palabras, una función importante de MglC y la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB es establecer la configuración de las proteínas de polaridad que confieren al módulo de polaridad capacidad de respuesta al sistema Frz. Volviendo a la pregunta planteada en la introducción, es decir, por qué se han seleccionado diferentes diseños de red en varias redes reguladoras de polaridad con resultados funcionalmente equivalentes, en el sistema de polaridad de S. cerevisiae que establece el único grupo Cdc42, la retroalimentación positiva se centra en Cdc42. y el Cdc24 GEF9. Por lo tanto, una vez que se establece el grupo Cdc42, esta polaridad se mantiene de manera estable y se evita eficientemente la descomposición de un sitio de yema naciente o la formación de sitios de yemas competidores. En el mutante ΔmglC, RomR, al estimular su propia unión polar en una retroalimentación positiva, provoca la localización polar de RomR/RomX y MglA en el mismo polo (Fig. 7f, panel inferior). Este diseño es conceptualmente similar al sistema de levadura que impulsa la formación de grupos de Cdc42. Por lo tanto, si bien los diseños de red de los sistemas de polaridad de M. xanthus y S. cerevisiae permiten la formación de un único grupo MglA/Cdc42, los diferentes cableados pueden racionalizarse como si el módulo de polaridad de M. xanthus fuera parte de un interruptor de palanca espacial que es óptimo para polaridad estable así como para inversiones rápidas de polaridad. Por el contrario, el sistema de S. cerevisiae está optimizado para proporcionar una polaridad estable.

En principio, parecería que la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB podría haberse establecido mediante la interacción directa de RomR con MglB, lo que plantea la cuestión de la ventaja de incorporar MglC en la retroalimentación positiva de RomR/MglC/MglB. La familia de proteínas del dominio de bloqueo es antigua, está abundantemente presente en todos los ámbitos de la vida y, a menudo, participa en la regulación de la actividad de la GTPasa37,46,47,48. Curiosamente, las Rag GTPasas de la vía mTOR están compuestas por un pequeño dominio GTPasa y un dominio de bloqueo C-terminal y forman heterodímeros utilizando sus dominios de bloqueo49. Estos heterodímeros son reclutados en los lisosomas por el complejo Ragulator, que contiene dos heterodímeros que interactúan de cabeza a cola formando un complejo tetramérico49. La interacción Rag GTPasa/Ragulator se produce a través de los dominios de bloqueo, lo que da como resultado tres capas de dominios de bloqueo heterodiméricos49. Curiosamente, el estado GTP/GDP de los heterodímeros Rag regula alostéricamente su unión a Ragulator ajustando la interacción entre pares de heterodímeros de bloqueo50,51. Este mecanismo es conceptualmente notablemente similar al estado GTP/GDP de MglA que regula la interacción entre los homodímeros MglC/MglB, lo que respalda que este mecanismo regulador se conserva evolutivamente. Sugerimos que la presencia de MglC en la retroalimentación positiva RomR/MglC/MglB refleja un antiguo mecanismo regulador en el que el estado GTP/GDP de una GTPasa asociada puede modular la interacción entre pares de dímeros de bloqueo.

Las cepas, plásmidos y cebadores utilizados en este trabajo se enumeran en las Tablas complementarias 1, 2 y 3, respectivamente. Todas las cepas de M. xanthus son derivadas de la cepa DK1622 WT52. M. xanthus se cultivó a 32 °C en caldo CTT al 1 %53 o en agar al 1,5 % suplementado con CTT al 1 % y kanamicina (50 µg ml-1) u oxitetraciclina (10 µg ml-1), según correspondiera. Las eliminaciones dentro del marco se generaron como se describe54. Los plásmidos se introdujeron en M. xanthus mediante electroporación y se integraron mediante recombinación homóloga en el locus endógeno o en el locus mxan18-19 o mediante recombinación específica de sitio en el sitio attB Mx8. Todas las eliminaciones en marco y las integraciones de plásmidos se verificaron mediante PCR. Los plásmidos se propagaron en Escherichia coli TOP10 (F-, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7679, galU, galK, rpsL, endA1, nupG). . E. coli se cultivó en LB o en placas que contenían LB suplementado con agar al 1,5% a 37 °C con antibióticos añadidos cuando correspondía55. Todos los fragmentos de ADN generados por PCR fueron verificados mediante secuenciación.

Los ensayos de motilidad basados ​​en la población se realizaron como se describe56. Brevemente, se recolectaron células de M. xanthus de cultivos en crecimiento exponencial a 4000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) y se resuspendieron en CTT al 1 % hasta una densidad calculada de 7 x 109 células ml-1. Se colocaron alícuotas de 5 µl de suspensiones celulares en placas de agar al 0,5 % suplementadas con CTT al 0,5 % para la motilidad dependiente de T4P y en placas de agar al 1,5 % suplementadas con CTT al 0,5 % para la motilidad deslizante y se incubaron a 32 °C. Después de 24 h, los bordes de las colonias se visualizaron usando un estereomicroscopio Leica M205FA y se tomaron imágenes usando una cámara digital CMOS Hamamatsu ORCA-flash V2 (Hamamatsu Photonics) usando el software LASX (Leica Microsystems). Para mayores aumentos de las células en los bordes de las colonias en agar al 1,5%, las células se visualizaron utilizando un microscopio invertido Leica DMi8 y se tomaron imágenes con una cámara Leica DFC9000 GT.

Las células individuales se rastrearon como se describe29. Brevemente, para la motilidad dependiente de T4P, se colocaron 5 µl de cultivos en crecimiento exponencial en una placa de poliestireno de 24 pocillos (Falcon). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, las células se cubrieron con 500 µl de metilcelulosa al 1% en tampón MMC (MOPS 10 mM (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico) pH 7,6, MgSO4 4 mM, CaCl2 2 mM), y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, las células se visualizaron durante 10 minutos a intervalos de 20 segundos a temperatura ambiente utilizando un microscopio invertido Leica DMi8 y una cámara Leica DFC9000 GT y el software LASX (Leica Microsystems). Las células individuales se rastrearon utilizando Metamorph 7.5 (Molecular Devices) e ImageJ 1.52. b57 y luego se calcula la velocidad de las células individuales por intervalo de 20 segundos, así como el número de reversiones por celda por 10 minutos. Para el deslizamiento, se colocaron 5 µl de cultivos de crecimiento exponencial en placas de agar al 1,5% suplementadas con CTT al 0,5%, se cubrieron con un portaobjetos y se incubaron a 32 °C. Después de 4 a 6 h, se observaron las células durante 15 min a intervalos de 30 s a temperatura ambiente como se describe, se calculó la velocidad por intervalo de 30 s y el número de reversiones por 15 min.

El análisis de inmunotransferencia se realizó como se describe55. α-MglA27 policlonal de conejo (dilución 1:5000), α-MglB27 (dilución 1:5000), α-RomR32 (1:5000), α-PilC58 (dilución 1:5000), α-PilO59 (dilución 1:2000) , Se utilizaron anticuerpos α-PilT60 (dilución 1:2000), α-mCherry (Biovision, dilución 1:15000) y α-MglC (dilución 1:5000) junto con inmunoglobulina G anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma) como anticuerpo secundario (dilución 1:10000). Se utilizaron anticuerpos de ratón α-GFP (Sigma, dilución 1:2000) y α-EF-Tu (HycultBiotech, dilución 1:5000) junto con inmunoglobulina G anti-ratón de oveja conjugada con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare) como anticuerpo secundario (dilución 1:2000). Para generar anticuerpos policlonales de conejo α-MglC, se purificó His6-MglC como se describe (ver más abajo) y se usó para la inmunización como se describe55. Las transferencias se desarrollaron utilizando el sustrato Luminata Crescendo Western HRP (Millipore) y se visualizaron utilizando un analizador de imágenes luminiscentes LAS-4000 (Fujifilm). Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE como se describe55.

Para la microscopía de fluorescencia, las células en crecimiento exponencial se colocaron en portaobjetos que contenían una almohadilla delgada de agarosa SeaKem LE al 1% (Cambrex) con tampón TPM (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, KH2PO4 1 mM, pH 7,6, MgSO4 8 mM) y CTT al 0,2%. y se cubre con un cubreobjetos. Después de 30 minutos a 32 ° C, las células se visualizaron utilizando un microscopio invertido Leica DMi8 con temperatura controlada y las imágenes de contraste de fase y fluorescencia se adquirieron utilizando una cámara digital CMOS Hamamatsu ORCA-flash V2 y el software LASX (Leica Microsystems). Para las grabaciones de lapso de tiempo, se tomaron imágenes de las células durante 15 minutos usando las mismas condiciones. Para inducir la expresión de genes del promotor inducible de vainilla, las células se trataron como se describe en presencia de vainilla 300 μM y se tomaron imágenes durante 6 h. Para cuantificar con precisión la localización de proteínas marcadas con fluorescencia, utilizamos un proceso de análisis establecido17 en el que el resultado de cada célula es la fluorescencia celular total, la fluorescencia total en grupos en cada polo y las fracciones medias de fluorescencia en cada uno de los dos polos. Los puntos de datos para células individuales se representaron en diagramas de dispersión en los que los polos con la fracción polar de fluorescencia más alta y más baja se definen como el polo 1 y el polo 2, respectivamente. La dispersión de las mediciones unicelulares se calcula y se muestra mediante barras de error y elipses en las que la dirección y la longitud de las barras de error están definidas por los vectores propios y la raíz cuadrada de los valores propios correspondientes de la matriz de covarianza de la fracción polar para cada cepa. Para calcular la fracción media de fluorescencia en los polos, se incluyeron células con y sin grupos. La cuantificación de las señales de fluorescencia se incluye en la Tabla complementaria 4.

Las imágenes del microscopio se procesaron con Fiji62 y las máscaras celulares se determinaron con Oufti63 y se corrigieron manualmente cuando fue necesario. La fluorescencia se cuantificó en Matlab R2020a (The MathWorks) como se describe17.

Los experimentos FRAP se realizaron como se describe64 con un microscopio Nikon Ti-E con temperatura controlada con Perfect Focus System y un objetivo de aceite Lambda CFI PL APO 100x/1.45 a 32 °C con una cámara Hamamatsu Orca Flash 4.0 usando el software NIS Elements AR 2.30 (Nikon ) en la oscuridad. El fotoblanqueo se realizó utilizando una única región de forma circular con un 20% de potencia láser (561 nm) y un tiempo de permanencia de 500 µs. Para cada imagen, se midieron las intensidades de fluorescencia integradas de una célula completa y la región de interés (ROI) blanqueada. Después de la corrección de fondo, la intensidad de fluorescencia corregida de la ROI blanqueada se dividió por la fluorescencia celular total corregida, corrigiendo los efectos de blanqueamiento durante la adquisición de la imagen. La segmentación celular y la corrección de fondo se realizaron con Oufti. Esta fluorescencia normalizada se correlacionó con la fluorescencia inicial en el ROI. La fluorescencia relativa media de las células se representó en función del tiempo. La tasa de recuperación de una proteína fluorescente determinada se determinó ajustando los datos trazados a una única ecuación exponencial con Matlab R2020a (The MathWorks).

Todas las proteínas se expresaron en E. coli Rosetta 2 (DE3) (F− ompT hsdSB (rB − mB −) gal dcm (DE3 pRARE2) a 18 °C o 37 °C. Para purificar proteínas marcadas con His6, se requiere afinidad Ni-NTA Brevemente, las células se lavaron en tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, imidazol 10 mM, glicerol al 5%, MgCl2 5 mM) y se resuspendieron en tampón de lisis A (50 ml de tampón de lavado A). suplementado con DTT 1 mM, 100 µg ml-1 de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 10 U ml-1 de DNasa 1 y una tableta de cóctel inhibidor de proteasa completa (Roche). Las células se lisaron mediante sonicación y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación (48.000 x g, 4 °C, 30 min) y filtración a través de un filtro de 0,45 µm (Sarsted). El lisado celular aclarado se cargó en una columna HiTrap Chelating HP de 5 ml (Cytiva) precargada con NiSO4 como lo describe el fabricante y preequilibrada en tampón A. La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón de lavado de columna (tampón A con imidazol 20 mM). Las proteínas se eluyeron con tampón de elución (tampón A con imidazol 500 mM) usando un gradiente lineal de imidazol de 20 a 500 mM. Las fracciones que contenían proteínas etiquetadas con His6 purificadas se combinaron y se cargaron en una columna de filtración en gel HiLoad 16/600 Superdex de 75 pg (GE Healthcare) que se equilibró con el tampón 1 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, MgCl2 5 mM, glicerol al 5%). Las fracciones que contenían proteínas marcadas con His6 se combinaron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Para purificar proteínas etiquetadas con MalE (MalE-RomR, MalR-RomR1–368, MalR-RomRC y MalE-MglC), se utilizó la purificación por afinidad de la proteína de unión a maltosa (MBP). Brevemente, las células se lavaron en tampón B (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM) y se resuspendieron en 50 ml de tampón de lisis B (50 ml de tampón B suplementado con PMSF 100 µg ml-1). , DNasa 1 10U mL-1 y tableta de cóctel inhibidor de proteasa completa (Roche)). Las células se lisaron y los lisados ​​celulares aclarados se prepararon como se describe y se cargaron en una columna MBPTrapHP (Cytiva) de 5 ml equilibrada con tampón B. La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón B. Las proteínas se eluyeron con tampón de elución B (tampón B con 10 maltosa mM). Las fracciones eluidas que contenían la proteína marcada con MalE relevante se cargaron en una columna de intercambio iónico HiTrap Q HP de 5 ml (Cytiva) equilibrada con tampón C (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, 5 % glicerol). La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón C. Las proteínas marcadas con Mal se eluyeron con tampón C usando un gradiente lineal de NaCl de 50 a 500 mM. Las fracciones que contenían las proteínas etiquetadas con MalE se cargaron en una columna de filtración en gel HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare) que se equilibró con el tampón 1. Las fracciones con proteínas etiquetadas con MalE se combinaron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. °C.

Para purificar proteínas marcadas con Strep, se utilizó purificación por afinidad con biotina. Brevemente, las células se lavaron en tampón C (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM) y se resuspendieron en tampón de lisis C (50 ml de tampón de lavado C suplementado con 100 µg mL-1 PMSF , 10U mL-1 DNasa 1 y tableta de cóctel inhibidor de proteasa completa (Roche)). Las células se lisaron y el lisado aclarado se preparó como se describe y se cargó en una columna Strep Trap HP (Cytiva) de 5 ml, equilibrada con tampón C. La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón C. La proteína se eluyó con tampón de elución C (tampón C con destiobiotina 2,5 mM). Las fracciones de elución que contenían proteínas marcadas con Strep se cargaron en una columna de filtración en gel HiLoad 16/600 Superdex de 75 pg (GE Healthcare) que se equilibró con el tampón 1. Las fracciones con proteínas marcadas con Strep se combinaron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. °C.

Para probar las interacciones con las variantes MglA, MglB y RomR, se incubó Strep-MglC (concentración final 10 µM) con MglA-His6, His6-MglB, MalE-RomR, MalE-RomR1–368 o MalE-RomRC (concentración final 10 µM). ) en tampón 1 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, MgCl2 5 mM, glicerol al 5%) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregaron 10 µl de perlas Strep-Tactin MagStrep' tipo 3' XT (IBA Lifesciences) previamente equilibradas con el tampón 1 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, las perlas se lavaron 10 veces con 1 ml de tampón 1. Las proteínas se eluyeron con 200 µl de tampón de elución (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, biotina 50 mM). Para probar las interacciones con MglC, MglA y MglB, se incubó MalE-RomR (concentración final 10 µM) con Strep-MglC, MglA-His6 y/o His6-MglB (concentración final 10 µM) en tampón 1 durante 30 minutos a temperatura ambiente. . Posteriormente, la mezcla se añadió a 200 µL de Resina de Amilosa, previamente equilibrada con el tampón 1, y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Luego se lavó la resina 10 veces con 1 ml de tampón 1. Las proteínas se eluyeron con 200 µl de tampón de elución (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, amilosa 10 mM). Para probar las interacciones con MglC, MglA y RomR, se incubó His6-MglB (concentración final 10 µM) con Strep-MglC, MglA-His6 y/o MalE-RomR (concentración final 10 µM) en tampón 1 durante 30 minutos a temperatura ambiente. . Posteriormente, se agregaron a la mezcla 20 µL de perlas magnéticas de níquel Amintra (Expedeon), previamente equilibradas con el tampón 1, y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se lavaron las perlas 10 veces con 1 ml de tampón 2 (tampón 1 con imidazol 50 mM). Las proteínas se eluyeron con 200 µl de tampón de elución (tampón 1 con imidazol 500 mM). En experimentos con MglA-His6, MglA-His6 (concentración final 10 µM) se precargó con GTP, GDP o GppNHp (concentración final 40 µM) durante 30 minutos a temperatura ambiente en el tampón 1 y todos los tampones contenían 40 µM del nucleótido relevante.

La hidrólisis de GTP por MglA-His6 se midió utilizando un ensayo continuo de GTPasa acoplada regenerativa65 en tampón de reacción (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 5 %, DTT 1 mM, MgCl2 7,5 mM) suplementado con NADH 495 µM. (Sigma), fosfoenolpiruvato 2 mM (Sigma), 18-30 U mL-1 piruvato quinasa (Sigma) y 27-42 U mL-1 lactato deshidrogenasa (Sigma). Para todos los ensayos, se precargó MglA-His6 (concentración final 2 µM) con GTP (concentración final 3,3 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente en tampón de reacción. En paralelo, se preincubó MglB con Strep-MglC, MalE-RomR y/o Strep-RomY durante 10 minutos a temperatura ambiente en tampón de reacción. Las reacciones de GTPasa se realizaron en placas de 96 pocillos (Greiner Bio-One) y se iniciaron añadiendo His6-MglB, Strep-MglC, MalE-RomR y/o Strep-RomY a la mezcla de MglA/GTP. Concentración final, MglA-His6: 2 µM, His6-MglB: 4 µM, Strep-MglC: 4 µM, MalE-RomR: 2 µM, Strep-RomY: 2 µM, GTP: 1 mM. La absorción se midió a 340 nm durante 60 min a 37 °C usando un lector de placas Infinite M200 Pro (Tecan) y se calculó la cantidad de GTP hidrolizado por hora por molécula de MglA-His6. Para cada reacción, la actividad de GTPasa restada de fondo se calculó como la media de tres réplicas técnicas.

Para probar la solubilidad de MglC-mVenus, MglCFDI-mVenus y MglCKRR-mVenus en células de M. xanthus se fraccionaron en fracciones enriquecidas con proteínas solubles e insolubles, incluidas las proteínas de la membrana interna y externa como se describe 66. Brevemente, se recolectaron cultivos de crecimiento exponencial a 11.000 g durante 10 min a temperatura ambiente y el sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis D (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM, suplementado con tableta de cóctel inhibidor de proteasa completa (Roche )). Las células se lisaron mediante sonicación y los lisados ​​se aclararon mediante centrifugación a 8000 g durante 5 minutos, temperatura ambiente. El lisado aclarado se sometió a ultracentrifugación utilizando un Air-Fuge (Beckman) a ~150.000 g durante 1 hora. El sedimento resultante contiene proteínas insolubles y se separó del sobrenadante, que contiene proteínas solubles, y se resuspendió en tampón de lisis D. Ambas fracciones se mezclaron con tampón de lisis SDS y se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. Como control de una proteína que forma cuerpos de inclusión se utilizó His6-PilT60 expresada en E. coli. Se utilizó EF-Tu como control para una proteína soluble de E. coli. Las células de E. coli se trataron como células de M. xanthus.

La MP se realizó utilizando un fotómetro de masas TwoMP (Refeyn Ltd, Oxford, Reino Unido). La adquisición de datos se realizó utilizando AcquireMP (Refeyn Ltd. v2.3). Las películas MP se grabaron a 1 kHz, con tiempos de exposición que variaron entre 0,6 y 0,9 ms, ajustados para maximizar el recuento de cámaras y evitar la saturación. Los portaobjetos de microscopio (1,5 H, 24 × 50 mm, Carl Roth) y las juntas reutilizables CultureWellTM se limpiaron con tres pasos de enjuague consecutivos con H2O bidestilada e isopropanol al 100 % y se secaron bajo una corriente de aire presurizado. Para las mediciones, se montaron juntas sobre cubreobjetos y se colocaron en la platina del fotómetro de masas con aceite de inmersión. Los cubreobjetos ensamblados se mantuvieron en su lugar mediante imanes. Para las mediciones, los pocillos de las juntas se llenaron con 10 µl de solución salina tamponada con fosfato 1X (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM) para permitir el enfoque de la superficie del vidrio. Después de enfocar, se agregaron 10 µL de muestra, se mezclaron rápidamente mientras se mantenía estable la posición de enfoque y se comenzaron las mediciones. Los valores de contraste de MP se calibraron según masas moleculares utilizando un estándar interno. Para cada muestra, se realizaron tres mediciones separadas. Los datos se analizaron utilizando el software DiscoverMP (Refeyn Ltd, v. 2022 R1). El análisis de imágenes MP se realizó como se describe67.

La predicción de la estructura del multímero AlphaFold (versión 2.3.1) se realizó con el pipeline ColabFold43,44,45. ColabFold se ejecutó con la configuración predeterminada donde se generaron múltiples alineamientos de secuencias con MMseqs268 y HHsearch69. La canalización ColabFold genera cinco rangos de modelos. Se generaron gráficos de prueba de diferencia de distancia local prevista (pLDDT) y de error de alineación (pAE) para cada rango con un script personalizado de Matlab R2020a (The MathWorks). La clasificación de los modelos se realizó en función de los valores combinados de pLDDT y pAE, y se utilizaron los modelos mejor clasificados para análisis y presentación adicionales. La precisión del modelo por residuo se estimó en función de los valores de pLDDT (>90, alta precisión; 70-90, generalmente buena precisión; 50-70, baja precisión; <50, no debe interpretarse)45. Las posiciones relativas de los dominios fueron validadas por pAE45. Para investigaciones adicionales solo se utilizaron modelos de la más alta confianza, basados ​​en valores combinados de pLDDT y pAE. Para todos los modelos, se utilizaron secuencias de proteínas de longitud completa.

Las alineaciones de secuencia se generaron usando ClustalOmega70 con parámetros predeterminados y las alineaciones se visualizaron con Jalview71. Los dominios de proteínas se identificaron utilizando Interpro72. La puntuación de carga se calculó utilizando la herramienta Protein-sol73. Las alineaciones estructurales y el cálculo del potencial de superficie electrostático se realizaron en Pymol (The PyMOL Molecular Graphics System, Versión 1.2r3pre, Schrödinger, LLC).

Las estadísticas se realizaron utilizando una prueba t de Student de dos colas para muestras con varianzas desiguales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos estructurales mencionados en este estudio están disponibles en la base de datos del Protein Data Bank con los códigos de acceso 6HJM (MglB), 7CY1 (MglC) y 6IZW (MglA unido a GTP-ɣ-S y MglB). Los autores declaran que todos los datos que respaldan este estudio están disponibles en el artículo, su archivo de información complementaria o en el archivo de datos fuente. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Los scripts MATLAB personalizados utilizados para el análisis de datos de fluorescencia y datos FRAP están disponibles a pedido del autor correspondiente.

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Descargar referencias

Agradecemos a la Dra. Anna McLoon por la generación de anticuerpos α-MglC. GKAH y LS-A. Agradezco con gratitud el apoyo financiero de la Sociedad Max Planck.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Departamento de Ecofisiología, Instituto Max Planck de Microbiología Terrestre, 35043, Marburg, Alemania

Luís António Menezes Carreira, Dobromir Szadkowski y Lotte Søgaard-Andersen

Grupo de Bioquímica Evolutiva, Instituto Max Planck de Microbiología Terrestre, 35043, Marburg, Alemania

Stefano Lometto y Georg. KA Hochberg

Departamento de Química y Centro de Microbiología Sintética, Universidad Philipps, 35043, Marburg, Alemania

Stefano Lometto y Georg. KA Hochberg

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Conceptualización: LAMC y LS-A. Trabajo experimental: LAMC, DS y SL Análisis de datos experimentales: LAMC y SL Redacción – borrador original: LAMC y LS-A. Redacción – edición de borrador: LAMC, DS, SL, GKAH y LS-A. Supervisión: GKAH y LS-A. Adquisición de financiación: GKAH y LS-A.

Correspondencia a Lotte Søgaard-Andersen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Beiyan Nan y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Carreira, LAM, Szadkowski, D., Lometto, S. et al. Bases moleculares y principios de diseño de polaridad anteroposterior conmutable y migración direccional en Myxococcus xanthus. Nat Comuna 14, 4056 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39773-y

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Recibido: 09 de diciembre de 2022

Aceptado: 28 de junio de 2023

Publicado: 08 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39773-y

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